Enzymologia 04-NB-ENZY-SP5

Wykłady:
Źródła informacji o enzymach. Osiągnięcia enzymologii a postęp nauk biologicznych. Enzymy jako biokatalizatory (zasada działania, specyficzność, zymogen, katalizatory niebiałkowe). Mechanizm działania enzymów – teorie, modele, metody pomiaru aktywności enzymatycznej. Wpływ warunków fizyko-chemicznych na szybkość reakcji enzymatycznej (kofaktory, koenzymy, grupy prostetyczne i reakcje przebiegające z ich udziałem). Witaminy a koenzymy. Klasyfikacja enzymów. Rola cynku w aktywowaniu karboksypeptydazy A, anhydrazy węglanowej, dehydrogenazy alkoholowej, alkalicznej fosfatazy, polimerazy DNA i RNA. Kinetyka reakcji enzymatycznych ( równanie Michaelisa-Menten). Omówienie sposobów wyznaczania stałych kinetycznych Km i Vmax. Enzymy allosteryczne i ich rola w kontrolowaniu metabolizmu. Układy wieloenzymatyczne – konjugaty wieloenzymatyczne. Indukcja i represja enzymatyczna jako procesy syntezy białek. Izoenzymy. Mutageneza i mutanty biochemiczne, przykłady stanów patologicznych. Znaczenie enzymów w technologii żywności oraz w degradacji detergentów. Badanie aktywności enzymów preparatach biologicznych, ich ekstrakcja i oczyszczanie.

Ćwiczenia:
I. Wykrywanie obecności i badanie aktywności enzymów z wykorzystaniem spektrofotometrii, alkacymetrii i spektrofluorymetrii:
1. Wykrywanie aktywności oksydoreduktaz (np. katalaza, peroksydaza, oksydaza fenolowa, oksydaza ksantynowa i in.) różnych materiałach biologicznych.
2. Badanie szybkości hydrolizy lipidów mleka i oznaczanie aktywności lipazy trzustkowej metodą alkacymetryczną.
3. Spektrofotometryczne oznaczanie aktywności dehydrogenazy mleczanowej.
4. Fluorymetryczne oznaczanie stężenia glukozy w reakcji katalizowanej przez heksokinazę i dehydrogenazę glukozo-6-fosforanową.
II. Kinetyka reakcji enzymatycznych, metody wyznaczania stałych kinetycznych:
1. Wpływ różnych czynników na aktywność enzymów: wyznaczanie optimum pH, wpływ temperatury oraz inhibitorów i aktywatorów na aktywność amylazy.
2. Wyznaczanie stałych kinetycznych reakcji hydrolizy białek soi przez pepsynę i papainę.
4. Zależność szybkości reakcji od stężenia substratu na przykładzie inwertazy. Zależność początkowej prędkości reakcji enzymatycznej od stężenia substratu.
5. Badanie termostabilności oraz wyznaczanie stałej Michaelisa- Menten (Km) dla - fruktofuranozydazy z drożdży.
6. Wyznaczanie stężenia kompetycyjnego inhibitora trypsyny – BPTI przez miareczkowanie mianowanego roztworu enzymu roztworem inhibitora.
7. Badanie wpływu czasu inkubacji na szybkość reakcji katalizowanej przez inwertazę .
III. Metody izolacji i oczyszczania enzymów:
1. Izolowanie i oznaczanie aktywności preparatów ureazy. Otrzymywanie i podczyszczanie - fruktofuranozydazy z drożdży. Badanie specyficzności substratowej wyizolowanych enzymów.
IV. Techniki immobilizacja enzymów:
1. Immobilizacja -amylazy na chitynie metodą sieciowania. Ocena użyteczności immobilizowanego enzymu. Badanie właściwości enzymu immobilizowanego. Wpływ pH, temperatury oraz aktywatorów i inhibitorów na aktywność immobilizowanego enzymu.
2. Immobilizacja trypsyny na stałym nośniku i pułapkowanie w żelu agarozowym.
V. Zastosowanie enzymów:
1. Enzymatyczna metoda otrzymywania D-glukozy ze skrobi.
2. Zastosowanie lipaz do selektywnej hydrolizy estrów.
3. Hydroliza skrobi przez unieruchomioną glukoamylazę.
4. Wpływ modyfikacji białek mleka i warunków reakcji hydrolizy kazeiny przez chymozynę na właściwości funkcjonalne produktów hydrolizy .
5. Synteza enzymatyczna in vitro na przykładzie reakcji katalizowanej przez karbamoilotransferazę ornitynową.